ISSN: 1859 - 2872
Tinh chế enzyme AaCas12b và ứng dụng phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas một ống
Main Article Content
Keywords
Tóm tắt
Mục tiêu: Tinh chế và ứng dụng enzyme AaCas12b trong kết hợp LAMP-CRISPR giúp chẩn đoán nhanh bệnh viêm màng não do Neisseria meningitidis. Đối tượng và phương pháp: Plasmid BPK2014-AaCas12b (#121949, Addgene) mang trình tự gen mã hóa cho protein AaCas12b được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21(λDE3). Sau đó, tinh chế enzyme này bằng cột sắc ký ái lực Niken. Enzyme AaCas12b sau tinh chế được ứng dụng trong phương pháp CRISPR/Cas kết hợp phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt LAMP giúp phát hiện nhanh Neisseria meningitidis. Kết quả: Biểu hiện và tinh sạch thành công enzyme AaCas12b có kích thước khoảng 130kD, có hoạt tính sinh học. Phản ứng kết hợp giữa LAMP và CRISPR/AaCas12b trong một ống phản ứng phát hiện Neisseria meningitidis với độ nhạy 102 bản sao/phản ứng trong tổng thời gian 60 phút. Kết luận: Enzyme AaCas12b tự tổng hợp có hoạt tính và có tính ứng dụng cao trong hệ thống cắt đặc hiệu CRISPR/Cas.
Article Details
Các tài liệu tham khảo
2. Shmakov S, Abudayyeh OO, Makarova KS, Wolf YI, Gootenberg JS, Semenova E, Minakhin L, Joung J, Konermann S, Severinov K, Zhang F, Koonin EV (2015) Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Mol Cell 60(3): 385-397.
3. Xu Y, Li Z (2020) CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Comput Struct Biotechnol J 18: 2401-2415. doi: 10.1016/j.csbj.2020.08.031.18: 2401-2415.
4. Strecker J, Jones S, Koopal B et al (2019) Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. Nat Commun 10(1): 212.
5. Li L, Li S, and Wang J (2018) CRISPR-Cas12b-assisted nucleic acid detection platform. bioRxiv preprint.
6. Lee D, Kim EJ, Kilgore PE, Kim SA, Takahashi H, Ohnishi M, Anh DD, Dong BQ, Kim JS, Tomono J, Miyamoto S, Notomi T, Kim DW, Seki M (2015) Clinical evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid detection of Neisseria meningitidis in cerebrospinal fluid. PLoS One 10(4): 0122922.
7. Seki M, Kilgore PE, Kim EJ, Ohnishi M, Hayakawa S, Kim DW (2018) Loop-mediated isothermal amplification methods for diagnosis of bacterial meningitis. Front Pediatr 6:57. doi: 10.3389/fped.2018.00057.
8. Teng F, Cui T, Feng G et al (2018) Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering. Cell Discov 4(1): 63.
9. Simpson RJ (2006) SDS-PAGE of proteins. CSH Protoc 2006(1):pdb.prot4313. doi: 10.1101/pdb.prot4313.
10. He F (2011) Bradford Protein Assay. Bio-101: e45. DOI: 10.21769/BioProtoc.45.
11. Đào Thị Huyền, Đào Thanh Quyên, Trần Thị Thanh, Ngô Tất Trung, Lê Hữu Song (2023) Biểu hiện enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp và ứng dụng trong khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện Neisseria meningitidis. Journal of 108-clinical medicine and pharmacy 18(5).
12. Zhang MS, Brunner SF, Huguenin-Dezot N, Liang AD, Schmied WH, Rogerson DT, Chin JW (2017) Biosynthesis and genetic encoding of phosphothreonine through parallel selection and deep sequencing. Nat Methods 14(7): 729-736. doi: 10.1038/nmeth.4302.
13. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72(1-2): 248-254.
14. Joung J, Ladha A, Saito M, Segel M, Bruneau R, Huang MW, Kim NG, Yu X, Li J, Walker BD, Greninger AL, Jerome KR, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F (2020) Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. medRxiv [Preprint]:2020.05.04.20091231. doi: 10.1101/2020.05.04.20091231.
15. Qiu X, Liu X, Ma X, Wang R, Chen S, Li F, Li Z (2022) One-pot isothermal LAMP-CRISPR-based assay for Klebsiella pneumoniae detection. Microbiol Spectr 10(4):e0154522. doi: 10.1128/spectrum.01545-22.
Article Sidebar
