Biểu hiện enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp và ứng dụng trong khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện Neisseria meningitidis

  • Đào Thị Huyền Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
  • Đào Thanh Quyên Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
  • Trần Thị Thanh Huyền Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
  • Trần Thị Thu Hiền Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
  • Ngô Tất Trung Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
  • Lê Hữu Song Bệnh viện Trung ương Quân đội 108

Main Article Content

Keywords

N. meningitidis, khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp, Bst Large Fragment

Tóm tắt

Mục tiêu: Biểu hiện enzyme Bst Large Fragment (BstLF) và ứng dụng trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện N. meningitidis. Đối tượng và phương pháp: Plasmid pET15b_BstLF_6XHis mã hoá enzyme Bst Large Fragment được biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3)pLysS. Enzyme Bst Large Fragment được biểu hiện bằng chất cảm ứng đặc hiệu (IPTG) và tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực. Đánh giá hoạt tính của enzyme Bst Large Fragment tự sản xuất và so sánh với enzyme thương mại trên mô hình vi khuẩn N. meningitidis. Kết quả: Điều kiện biểu hiện cho hiệu suất tốt nhất ở 37oC trong 4 giờ với 1mM chất cảm ứng IPTG. Bst Large Fragment thu được có độ tinh sạch cao, có hoạt tính tốt. Ứng dụng enzyme BstLF tự sản xuất trong phản ứng LAMP phát hiện N. meningitidis được thiết lập trong vòng 50 phút với độ nhạy 102 bản sao/phản ứng, độ tin cậy 95%. Kết luận: Biểu hiện thành công enzyme BstLF và ứng dụng trong xét nghiệm LAMP phát hiện N. meningitidis với ngưỡng phát hiện là 102 bản sao/phản ứng tương đương với enzyme thương mại Bst 3.0 DNA Polymerase.

Article Details

Các tài liệu tham khảo

1. Oliveira BB, Veigas B and Baptista PV (2021) Isothermal amplification of nucleic acids: The race for the next "gold standard". Front. Sens. 2:752600.
doi: 10.3389/fsens.2021.752600.
2. Mori Y, Notomi T (2009) Chemotherapy, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J Infect Chemother 15(2): 62-69.
3. Alhassan A, Li Z, Poole CB, Carlow CK (2015) Expanding the MDx toolbox for filarial diagnosis and surveillance. Trends Parasitol 31(8): 391-400.
4. Aviel-Ronen S, Qi Zhu C, Coe BP, Liu N, Watson SK, Lam WL, Tsao MS (2006) Large fragment Bst DNA polymerase for whole genome amplification of DNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. BMC Genomics 7: 1-10.
5. Ma Y, Zhang B, Wang M, Ou Y, Wang J, Li S (2016) Enhancement of polymerase activity of the large fragment in DNA polymerase I from Geobacillus stearothermophilus by site-directed mutagenesis at the active site. Biomed Res Int 2016:2906484. doi: 10.1155/2016/2906484.
6. Wang G, Ding X, Hu J et al (2017) Unusual isothermal multimerization and amplification by the strand-displacing DNA polymerases with reverse transcription activities. Sci Rep 7, 13928. https://doi.org/10.1038/s41598-017-13324-0.
7. Simpson RJ (2006) SDS-PAGE of proteins. CSH Protoc 2006(1):pdb.prot4313. doi: 10.1101/pdb.prot4313.
8. He F (2011) Bradford protein assay. Bio-101: e45. DOI: 10.21769/BioProtoc.45.
9. Du F, Liu YQ, Xu YS, Li ZJ, Wang YZ, Zhang ZX, Sun XM (2021) Regulating the T7 RNA polymerase expression in E. coli BL21 (DE3) to provide more host options for recombinant protein production. Microb Cell Fact 20(1):189. doi: 10.1186/s12934-021-01680-6..
10. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254. doi: 10.1006/abio.1976.9999.
11. Luo Z, Ye C, Xiao H, Yin J, Liang Y, Ruan Z, Luo D, Gao D, Tan Q, Li Y, Zhang Q, Liu W, Wu J (2022) Optimization of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for robust visualization in SARS-CoV-2 and emerging variants diagnosis. Chem Eng Sci 251:117430. doi: 10.1016/j.ces.2022.117430.
12. Hardinge P, Murray JAH (2019) Murray, Reduced false positives and improved reporting of loop-mediated isothermal amplification using quenched fluorescent primers. Sci Rep 9, 7400 . https://doi.org/10.1038/s41598-019-43817-z.
13. Baskaran N, Kandpal RP, Bhargava AK, Glynn MW, Bale A, Weissman SM (1996) Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content. Genome Res 6(7): 633-638. doi: 10.1101/gr.6.7.633.
14. Zou Y, Mason MG, Botella JR (2020) Botella, Evaluation and improvement of isothermal amplification methods for point-of-need plant disease diagnostics. PLoS One 15(6):e0235216. doi: 10.1371/journal.pone.0235216.
15. da Silva SJR, Pardee K, Balasuriya UBR, Pena L (2021) Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Sci Rep 11(1): 4111. doi: 10.1038/s41598-021-83371-1.

Article Sidebar

PDF
Đã đăng
Aug 8, 2023
DOI: https://doi.org/10.52389/ydls.v18i5.1882
Số tạp chí
Tập 18 - Số 5/2023
Chuyên mục
Articles
Trích dẫn bài viết này
Huyền Đào T., Quyên Đào T., HuyềnT. T. T., HiềnT. T. T., TrungN. T., & SongL. H. (2023). Biểu hiện enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp và ứng dụng trong khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện Neisseria meningitidis . Journal of 108 - Clinical Medicine and Phamarcy, 18(5). https://doi.org/10.52389/ydls.v18i5.1882